### 人骨肉瘤细胞HOS培养说明书
#### 一、细胞培养条件
细胞名称：人骨肉瘤细胞HOS
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：MEM + 10% FBS + 1% NEAA + 1% P/S
传代方法：第一次建议1:2传代
备注：用无菌离心管收集培养基以便进行过渡对比培养。如对比效果不佳，建议直接购买Z6·尊龙凯时的完全培养基。
#### 二、细胞收到后的处理
在将细胞培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后进行后续处理。显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（最好各取一张40x、100x、200x），前3天照片是重要的售后依据，未提供照片默认收到状态良好。如进行传代，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基以便进行对比，换液后将瓶盖稍微松开。
#### 三、细胞培养步骤
a. 细胞传代：如果汇合度未超过80%，将培养液收集至离心管中，留下5ml完全培养基置于37℃、5% CO2孵箱中；如果细胞密度超过80%，则可以进行传代，具体步骤如下：
- 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
- 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台，轻敲培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
- 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，用1-2ml完全培养基重悬。
- 按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
b. 细胞冻存：
- 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次；
- 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；
- 弃去上清，将沉淀细胞加入1ml的Z6·尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
- 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐中。
c. 细胞复苏：
- 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁；
- 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；
- 弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，然后接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养；
- 第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。
#### 四、注意事项
有些细胞贴壁不牢，运输过程中可能发生细胞脱落，这属于正常现象。如脱落较多，可收集所有培养液至离心管中，进行1000RPM离心5分钟，收集上清以作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟，再加入5ml完全培养基终止反应。接着再离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重新悬浮。最后按1:2比例进行传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
#### 五、售后条款
1）出现问题时可重发的情况及判断标准：
- 若在运输途中遭遇问题，如细胞丢失、瓶身破损或培养液严重漏液可以重发；
- 细胞污染问题需在收到产品48小时内提出真实的实验结果，核实后可重发；
- 常温发货细胞静置24小时后，干冰运输的细胞复苏后24小时内大多数细胞未存活（需提供细胞状态照片）可重发；
- 干冰运输细胞复苏24小时后或常温发货的细胞静置4小时未开封且出现污染可重发；
- 细胞活性问题需在收到产品7天内提真实结果，采用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后可重发；
- 收到细胞当天及第2、3天请拍照，3天未告知视为产品合格。
- 4-7天内若出现问题需提供收到细胞前3天照片、问题照片及操作步骤，技术人员核查后若确认为我方责任将重发，否则双方协商处理或按合同价的50%收取重发费用。
2）出现问题时不予重发的情况：
- 如因客户造成细胞污染，不予重发；
- 如因客户不当操作导致细胞状态不佳，不予重发；
- 使用非推荐培养体系导致细胞状态不良，不予重发；
- 细胞状态不佳且未提供细胞培养前3天照片，不予重发；
- 细胞培养过程中经其他处理，不予重发；
- 若收到后2天内未告知情况，不予重发；
- 其他情况视具体情况而定。
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